奧林巴斯顯微鏡BX53的觀察方式

明場觀察

通常所說的明場，指的是由顯微鏡光源的照明光經(jīng)過聚光鏡匯聚照射到標本上，被標本吸收后，剩余的光進入物鏡，然后通過目鏡被人眼看到或者被通過C接口被攝像頭拍到。照明光路采用科勒照明或臨界點照明。

血涂片、革蘭氏染色的細菌涂片、染色的病理切片、植物的切片、骨磨片等都采用明場方式觀察。這幾類標本比較適合用正置顯微鏡觀察，與倒置顯微鏡相比，正置顯微鏡的聚光鏡可以離標本很近，數(shù)值孔徑比較大，所以整體的分辨率要比倒置鏡高，看標本更清楚。

明場觀察的要求主要是結(jié)構(gòu)清晰、顏色準確，如何保證清晰準確呢？

首先是制片，為了盡可能的看到清晰的結(jié)構(gòu)，我們先注意一下標本制備中要不要封片以及如何封片的問題，因為不同的物鏡對標本封片與否的要求是不一樣的。

如下圖中的三個物鏡，參數(shù)中的“0.17"表示在該物鏡下觀察的標本需要用厚度為0.17mm的蓋玻片封片；參數(shù)“0"表示在該物鏡下觀察的標本不能用蓋玻片封片，適合各種涂片或磨片；參數(shù)“-"表示該物鏡對封片與否沒有要求，封片或不封片的標本都可以觀察。

圖1 光學顯微鏡中物鏡上的重要參數(shù)

對于需要封片的標本，標本要浸沒在封片劑中，再蓋上蓋玻片，不可以不加封片劑直接蓋蓋玻片。封片劑的折射率一般與標本接近，盡量減少成像光路中折射率的突兀變化，以保證最佳通透性。生物組織的折射率一般在1.3~1.5之間，蓋玻片的玻璃折射率為1.52左右，油鏡的油折射率為1.518，所以封片劑的折射率一般不超過1.518。

圖2 光學顯微鏡制片示意圖

其次是顯微鏡組件參數(shù)，數(shù)值孔徑（NA）是物鏡和聚光鏡的固有參數(shù)，物鏡的數(shù)值孔徑（NA）越大分辨率越高，看到的標本就越清楚。同樣，聚光鏡的數(shù)值孔徑越大分辨率越高。所以選擇數(shù)值孔徑比較大的物鏡和聚光鏡有助于看清更多的標本細節(jié)孔徑光闌（Aperture）位于聚光鏡上，孔徑數(shù)值可調(diào)，也影響分辨率，孔徑數(shù)值越大顯微鏡成像分辨率越高。

圖3 孔徑光闌

注意：物鏡和聚光鏡的數(shù)值孔徑越大，其工作距離（或者理解為焦距）越短。孔徑光闌數(shù)值越大，顯微鏡成像的對比度越低，景深越小。

另外，照明光源的色溫會影響到顯色效果。同一個標本，照明色溫比較低時，標本中的紅色就比較鮮艷，藍色比較暗；相反色溫偏越高時，標本中藍色就越鮮艷紅色越暗。

顯微鏡常用作明場照明的光源有兩種：鹵素燈和LED燈。

鹵素燈的整體色溫比較低，看起來明顯偏黃色，一般會在照明光路里加一個日光濾片提高色溫，使標本的顏色更均衡。然而鹵素燈的色溫會隨著燈的亮度而變化，燈調(diào)節(jié)的越亮，色溫越高。我們知道在使用顯微鏡從低倍物鏡轉(zhuǎn)換到高倍物鏡時，需要調(diào)亮照明光來保證目鏡觀察到的視野亮度一致，這樣就會導致色溫升高，從而使得高倍鏡看到的標本中藍色結(jié)構(gòu)比低倍鏡中更鮮艷，而低倍鏡中看到的紅色結(jié)構(gòu)更鮮艷。要解決這個色彩偏差，方法有：

基礎(chǔ)的顯微鏡可以配置恒定亮度的物鏡組，低倍鏡跟高倍鏡的亮度一樣，這樣就不需要調(diào)整燈的亮度。

高級的全自動顯微鏡使用恒定色溫轉(zhuǎn)輪，根據(jù)不同物鏡自動調(diào)整鹵素燈亮度并自動調(diào)節(jié)色溫轉(zhuǎn)輪，來使最終的照明色溫保持恒定。

使用恒定色溫的照明光源：LED燈。

LED燈的色溫恒定，不會隨亮度變化。顯微鏡明場照明用的LED燈通常色溫恒定在５０００Ｋ，接近太陽光的平均色溫。

最后使用顯微鏡配備的攝像頭拍照時，如果發(fā)現(xiàn)電腦屏幕上呈現(xiàn)的圖像偏色，就需要先做一下白平衡。

圖4 選取視野中的空白區(qū)域作為參照進行白平衡

顏色的鮮艷程度則可以通過色飽和度調(diào)節(jié)，飽和度越高，圖像色彩越艷麗，飽和度低時，圖像就失去色彩呈現(xiàn)為黑白色。

需要注意的是，不必要求屏幕上顯示的標本顏色跟目鏡里看到的*一致，因為任何顯示器所能顯示的顏色都是有限的，如下圖所示，在Ｌａｂ色域圖中，舌頭形狀的區(qū)域為人眼所能看到的顏色，專業(yè)的顯示器執(zhí)行Ａｄｏｂｅ　RGB標準，所能呈現(xiàn)的顏色為黑色虛線三角形內(nèi)的區(qū)域，一般的顯示器執(zhí)行ｓＲＧＢ標準，能呈現(xiàn)的顏色就更少了。

圖5 人眼與不同顯示器觀察到的色域不同

相差成像

檢查培養(yǎng)中的活細胞的生長狀態(tài)時，常用相差方法觀察。因為活細胞一般不染色，細胞比較透明，直接用明場觀察的話不容易看清楚，用相差方式可以提高反差（下圖），更容易看清細胞狀態(tài)。

圖6 活細胞觀察對比

顯微鏡要實現(xiàn)相差效果需要兩個條件：相差物鏡和相差環(huán)，觀察時需要選擇相差物鏡并將對應的相差環(huán)移入光路。相差物鏡上會有標志“PH０"、“PH１"、“PH２"等，數(shù)字表示對應的相差環(huán)型號，另外相差環(huán)上也會明確標注對應的物鏡倍數(shù)，使用相差時一定要保證物鏡和相差環(huán)正確匹配。

圖7 相差成像設備圖解

暗場成像

實際是暗場照明法。不直接觀察到照明的光線，而觀察到的是被物體反射或散射的光線，暗背景，樣品閃亮（下圖）。適合觀察微小水生生物、纖維、毛發(fā)、細菌，以及進行尿檢等。

圖8 明暗成像對比

圖9 暗場成像下的小水生生物

暗場觀察所需要的特殊附件是暗場環(huán)和聚光鏡，聚光鏡的數(shù)值孔徑至少比所用物鏡大０.２才可以實現(xiàn)較好的暗場效果。

圖10 暗場成像原理

微分干涉（DIC）成像

如果細胞標記了熒光，就不太適合再用相差物鏡觀察了，因為相差物鏡內(nèi)有相位環(huán)，會阻擋部分熒光，此時比較適合的反差增強方法是DIC。DIC可以用高透光的復消色差物鏡搭配DIC棱鏡和偏光片來實現(xiàn)，拍攝熒光時DIC組件可以從光路中移除，不會對熒光成像產(chǎn)生影響。

DIC呈現(xiàn)出漂亮的3D圖像（非真實三維圖像），無光暈，分辨率大于相差，適合搭配熒光，但是不適合在塑料器皿中成像。

圖11 DIC下的細胞成像

DIC成像時需要在光路中移入４個組件，相對比較復雜，所以一般配在全自動顯微鏡上，由顯微鏡自動控制各個組件，以方便使用者操作。并可實現(xiàn)長時間定時拍攝，記錄動態(tài)過程。

整合調(diào)制反差（IMC）成像

顯微操作時，需要標本呈現(xiàn)出一定的立體效果，DIC雖然有立體效果，但是用DIC時不能用塑料器皿，而顯微操作多數(shù)都是在塑料器皿里進行的。整合調(diào)制反差（IMC）或者霍夫曼反差（HMC）正好滿足這個需求。

IMC或者HMC是一種斜照明效果，一側(cè)的狹縫照明造成陰影，產(chǎn)生立體效果?？捎糜谒芰掀髅髢?nèi)標本的顯微操作。

圖12 IMC成像適用于顯微操作

HMC需要專用的物鏡搭配聚光鏡上的調(diào)制器，專用物鏡對熒光有一定的阻擋。IMC無需專用物鏡，可用普通物鏡搭配調(diào)制器實現(xiàn)，對熒光成像沒有影響。

奧林巴斯顯微鏡BX53的觀察方式